提高高通量测序中分子定量的准确性

NDORMS 的一个团队开发了一种新方法，可以显着提高 RNA 测序的准确性。他们查明了短读长和长读长 RNA 测序中定量不准确的主要原因，并引入了“多数投票”纠错的概念，从而使 RNA 分子计数得到了实质性改进。

遗传物质的准确测序在现代生物学中至关重要，特别是对于理解和解决与遗传异常相关的疾病。然而，当前的方法遇到很大的限制。

在一项具有里程碑意义的研究中，由牛津大学计算生物学副教授 Adam Cribbs 和牛津大学 Botnar 研究所博士后研究员孙建峰领导的国际研究人员开发了一种创新方法来纠正 PCR 扩增中的错误——高通量测序中广泛使用的技术。

通过将 PCR 伪影确定为不准确定量的主要来源，研究人员解决了生成准确的 RNA 分子绝对计数的长期挑战，这对于基因组学研究的各种应用至关重要。该研究发表在《自然方法》杂志上。

研究人员重点关注独特分子标识符 (UMIs)，这是一种随机寡核苷酸序列，用于消除 PCR 扩增过程中引入的偏差。虽然 UMI 已广泛应用于测序方法中，但研究表明 PCR 错误可能会破坏分子定量的准确性，特别是在不同的测序平台上。

建峰解释说：“PCR 扩增对于大多数 RNA 测序技术至关重要，但可能会引入错误，损害数据完整性。我们通过使用同源三聚体核苷酸块合成 UMI 条形码来解决这个问题，增强纠错能力并实现近乎绝对的 RNA 分子定量，显着改善分子计数准确性。”

同源三聚体是由三个相同碱基组成的核苷酸序列，例如AAA、CCC、GGG。通过评估同源三聚体核苷酸相似性，通过“多数投票”方法检测并纠正错误(见上图)。

研究表明，在分析差异表达基因和转录本(DEG 和 DET)期间，同源三聚体 UMI 在减少假阳性倍数富集方面显着优于传统单体 UMI。这种增强对于 DEG 或 DET 的准确识别和定量至关重要，特别是在批量测序方法中。

此外，在单细胞测序中，通常需要大量的 PCR 扩增，同源三聚体 UMI 已被证明可以有效减轻 PCR 伪影的影响，从而大大提高测序数据的可靠性。

该论文的资深作者兼小组负责人 Adam Cribbs 副教授表示：“通过从同质核苷块构建 UMI，我们的目标是改善短读长和长读长测序的错误纠正，展示我们对增强测序技术应用的承诺。”在计算生物学中。

这项研究具有深远的意义。通过纠正 UMI 中的 PCR 错误，它极大地提高了各种测序应用中的分子定量准确性。它是批量 RNA、单细胞 RNA 和 DNA 测序研究人员的重要工具，可实现准确的基因表达和分子谱分析。

增强的 UMI纠错不仅减少了误报的发生率，而且还提供了多种诊断应用，特别是在需要对样本进行纵向分析的情况下。