干细胞编辑修复严重的免疫缺陷

时间适应性免疫系统的B细胞和T细胞能够识别进入体内的传染性微生物的独特特征。他们利用B细胞和T细胞受体完成了这一壮举，这些受体具有不同的形状，可以与外来入侵者的不同抗原结合。重组激活基因1(RAG1)是这种变形行为的核心。1它会打乱这些受体基因中DNA序列的顺序，产生多种版本的免疫受体，可以结合惊人的抗原组合。然而，有些人携带RAG1突变，导致该酶无法重组编码这些受体的DNA序列。如果没有正常运作的受体，B细胞和T细胞就无法发育，导致严重的联合免疫缺陷(SCID)，在这种情况下，即使是最轻微的感染也可能致命。在《科学转化医学》杂志上发表的一项研究中，研究人员开发了一种有效的方法来修复取自SCID患者的称为造血干细胞(HSC)的免疫细胞祖细胞中的RAG1基因，并表明它们可以恢复小鼠的免疫功能。2

当你想要修正基因时，你必须记住，在基因附近，有很多与正确基因表达相关的调控元件。

-MariaCarminaCastiello，圣拉斐尔科学研究所

圣拉斐尔科学研究所的两位转化免疫学家MariaCarminaCastiello和AnnaVilla着手克服研究人员之前面临的编辑RAG1基因的一些挑战。过去，科学家们将健康、有功能的造血干细胞植入SCID模型小鼠体内，但它们经常被其他类型的免疫细胞破坏，这些免疫细胞将移植物识别为外来物。3通常，医生在移植前使用化疗等免疫抑制剂来消耗免疫细胞，但这对于SCID患者来说不是一个选择。“这种疾病可能会导致严重的器官损伤，因此患者的病情危重，不允许他们接受化疗，”维拉解释道。

Castiello和她的同事采取了不同的方法，修改SCID患者自身的干细胞以表达功能性RAG1基因。虽然其他研究小组已成功将RAG1添加到患者HSC中，但他们无法正确调节该基因的表达，因此无法确保干细胞安全或能有效补充B和T细胞。

将基因引入基因组中错误的位点可能是造成这一缺陷的部分原因。“当你想要纠正基因时，你必须记住，在基因附近，有很多与正确基因表达相关的调控元件，”卡斯蒂洛说。

研究人员决定修改现有的副本，确保监管网络保持完整，而不是添加RAG1的功能副本。事实上，其他研究人员采用类似的方法编辑RAG2时取得了成功。4

然而，在卡斯蒂洛和她的团队修复基因之前，他们必须选择编辑策略。一些研究人员使用碱基编辑，修改DNA序列中的单个字母，以纠正这些干细胞的其他遗传疾病，如镰状细胞病和β地中海贫血。5

然而，RAG-1突变可能发生在基因内的多个不同位点，因此碱基编辑无法涵盖所有​​类型的突变。相反，研究小组使用成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR-Cas9)系统切除大部分突变基因，然后使用慢病毒递送系统为细胞提供正确的DNA序列。由于正确的序列与原始基因几乎相同，因此细胞可以使用同源定向修复(HDR)来交换序列，HDR是一种内置的DNA修复途径，可使用互补DNA作为模板来修复双链DNA断裂。

Castiello和她的同事将HSC的旧突变编码序列替换为新的编码序列后，他们必须测试该基因是否产生功能性RAG1蛋白。他们插入了一个反向绿色荧光蛋白(gfp)基因，其两侧是RAG1识别的序列。令人欣喜的是，他们发现，编辑后的​​RAG1与来自健康供体的HSC中的RAG1类似地反转了gfp，从而将其切换到“开启”状态，从而产生了功能性gfp基因。

接下来他们必须检查这些编辑过的细胞是否可以恢复体内的免疫功能。他们将这些经过编辑的人类细胞移植到SCID模型小鼠中，发现B细胞和T细胞激增至与接受健康捐赠者HSC的小鼠相似的水平。

“这项研究的有趣之处在于我们不需要纠正所有的干细胞。如果我们设法纠正至少10%的干细胞，这将为我们带来治疗益处。”未参与这项工作的干细胞研究和再生医学研究所的遗传学家SaravanabhavanThangavel说道。不过，他也提到，“我们需要长期跟踪HDR编辑的细胞。”研究人员需要确保改造后的细胞能够持续存在于SCID患者体内，这样他们新获得的免疫力就不会随着时间的推移而减弱。Thangavel补充道：“如果HDR编辑的细胞偶然消失，它们可能不会产生治疗效果。”

该团队的目标是完善他们的协议。“我们正在努力提高我们所实现的编辑效率，”卡斯蒂洛说。她还希望通过比较不同的方法来优化将基因传递到细胞中。在这项研究中，他们使用慢病毒将DNA模板传递到干细胞，但他们计划测试其他策略，例如使用隐藏DNA模板并与细胞膜融合的脂质纳米颗粒导管，将DNA释放到细胞中。

卡斯蒂洛补充说，该团队还必须测试这种基因编辑策略的安全性，并找到一种扩大编辑干细胞生产规模的方法。然后他们应该能够在人体中测试他们编辑的细胞，希望最终能够治疗由RAG1缺陷引起的各种疾病。“我们确实致力于将我们的策略转化为临床，”她说。